厉害了！长寿蛋白SIRT6可促进脂肪燃烧，预防脂肪肝

肥胖、2型糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病正在成为21世纪的流行病，它们在公共卫生和经济成本方面对社会的影响是巨大的。2019年12月17日，cell子刊Cell Reports报道了巴伊兰大学Haim Y. Cohen教授团队的研究“SIRT6 Promotes Hepatic Beta-Oxidation via Activation of PPARα”，论文证明长寿蛋白SIRT6在促进脂肪燃烧、调控肝脏脂肪代谢中起着重要作用。

研究背景：Sirtuins是一类NAD+（脱氢酶的辅酶）依赖性去乙酰化酶家族，具有调节寿命和年龄相关代谢性疾病的作用。在7种哺乳动物Sirtuins中，SIRT6被证明可以调节寿命和各种生理途径，包括胚胎发育、DNA修复、转座子稳定性、碳水化合物、胆固醇和脂肪的代谢、炎症、昼夜节律、癌症和衰老等。灵长类动物中SIRT6的缺失或人类中SIRT6的失活突变是致命性的，而转基因(TG)小鼠中SIRT6的过度表达则能增加雄性的寿命。在小鼠和灵长类动物模型中都被认为可以延长寿命的卡路里限制(CR)会增加SIRT6水平。这表明SIRT6可能介导CR的有益作用。SIRT6还被发现肝特异性KO会导致肝脂肪变性增加和β-氧化降低。然而目前对于SIRT6在β氧化方面的了解仍然有限。

PPARα是一种过氧化物酶体增殖物激活受体亚型，是肝脏β-氧化的关键转录因子。在禁食等需要脂肪酸氧化的条件下，PPARα会通过上调脂肪氧化所需酶(如CPT1α)的表达来确保能量的有效性。一旦被激活，PPARα会促进脂肪酸的β氧化，释放游离脂肪酸，从而增加乙酰辅酶A的生成。除了在β氧化中的直接作用外，PPARα还通过激活PDK4抑制糖酵解衍生的丙酮酸氧化，并通过增加乳酸和丙氨酸等糖异生前体间接地推动肝脏向脂质氧化。此外，PPARα被证明可以抑制SREBP介导的胆固醇和甘油三酯的合成。

PPARα与SIRT6都与肝脏β氧化、炎症和昼夜节律调节有关，在饥饿或CR条件下，它们的活动都增强。这些发现表明，SIRT6和PPARα之间可能存在协同调节的相互作用。

研究内容：研究者们先对WT和SIRT6杂合子(HZ)小鼠（SIRT6缺乏）肝脏进行基于RNA测序(RNA-seq)的定量转录组分析，对高差异表达(DE)基因进行qpcr验证，结果发现，HZ小鼠中被差异调节的前三条通路都与β氧化直接相关。IPA分析发现作为β氧化的中间步骤，酰基辅酶A（Acyl-CoA）水解是最显著的调节途径。排名第二的途径是甘油三酯降解，这一步甘油三酯水解成脂肪酸，用于β氧化。第三个途径，硬脂酸生物合成，涉及到饱和脂肪酸的合成。已被确定为DE基因的上游调节因子的PPARα也受到最显著的抑制。结果显示SIRT6和PPARα都位于脂质代谢网络的中心位置，这表明这两种蛋白在调节脂肪代谢方面可能相互协调。此外，使用ExpressionBlast工具将HZ的肝脏DE基因与当前GEO数据库中的所有微阵列进行比较，发现前三名的高度显著性匹配为PPARα KO微阵列，这表明SIRT6 HZ小鼠的基因表达谱与PPARα KO小鼠极其相似。这些发现强烈提示SIRT6激活PPARα。

为了探讨SIRT6激活PPARα信号的机制，研究者们先检测了WT 和HZ小鼠的PPARα水平和乙酰化水平。PPARα的mRNA水平二者类似，在PPARα上没有检测到乙酰化。因此作者又猜想二者是否存在物理上的相互作用，结果显示无论是内源性还是外源性的PPAR都可以与SIRT6 发生免疫共沉淀，表明SIRT6与PPARα特异性结合。利用微流体蛋白结合平台定量显示SIRT6与PPARα的结合亲和力明显高于HIF1a（已知的SIRT6相互作用蛋白），表明PPARα与SIRT6之间存在很强的相互作用。为了检测SIRT6是否与PPARα相互作用的DNA反应元件—— PPRE直接结合，以及这种相互作用是否需要PPARα，研究者们使用了(QPID)微流体法，结果显示在PPARα存在的情况下，SIRT6与PPRE的结合显著而强烈，但对突变的PPRE序列的亲和力不明显，这些发现表明SIRT6以一种PPARα依赖的方式与PPRE特异性结合。荧光素酶报告基因检测同样显示在体内SIRT6可以激活PPRE，且这种反应SIRT6酶活性是必需的（无催化活性的突变体SIRT6 H133Y无法激活PPRE的转录活性）。此外，在SIRT6过表达细胞中，PPARα过表达可进一步诱导PPRE。因此，这两种蛋白可能协同激活PPRE。这些数据表明，SIRT6通过PPARα直接激活PPRE。

由于SIRT6被发现与PPRE结合(上图)，作者于是研究了SIRT6对各种肝脏PPARα信号通路转录的影响。先前已有研究证明，经WY（PPARα激活剂）处理后，小鼠肝脏和原代肝细胞中均能观察到PPARα转录的强烈诱导，这些途径包括线粒体β氧化、过氧化物酶体β氧化、酰基辅酶A结合/水解、脂质储存/运输和酮生成。在本实验中，SIRT6 HZ的原代肝细胞始终显示PPARα激活减少。相反，与WT相比，SIRT6 TG小鼠（SIRT6过表达）在原代肝细胞中显著增加了PPARα的诱导。体内实验也是类似结果。有趣的是，正如之前在小鼠而非原代肝细胞中所显示的，脂质转运基因Slc27a1可经由WY处理诱导， SIRT6进一步激活了该基因。此外，SIRT6还增加了Fgf21的表达，这是PPARα活性的一个关键因素。这些结果表明，SIRT6在多种途径上促进了PPARα依赖的转录活性。

随后，作者又检测了SIRT6对一系列PPARα调控途径下游的影响，包括β氧化、糖异生和甘油运输，以及抑制糖原分解和丙酮酸代谢的能力。实验发现，经过WY处理后，HZ小鼠的PDK4和P-PDC蛋白水平（丙酮酸氧化），Cd36的RNA水平、长链脂肪酸氧化产物乙酰肉碱代谢物水平、最终产物CO2水平（脂肪酸β氧化），甘油转运蛋白Aqp3的RNA水平、乳酸和丙氨酸代谢产物均显著下降，以往研究证明WY处理可抑制糖原分解基因Pygl的表达，激活糖原合成基因Gys2，但这种效应在HZ小鼠中几乎完全消失。

与HZ小鼠相反，在禁食条件下，SIRT6 TG小鼠中SIRT6过表达导致了丙酮酸水平显著升高，丙酮酸氧化受到抑制，β氧化代谢物乙酰肉碱升高。此外，饥饿的TG小鼠甘油水平显著升高。这些代谢物的变化与丙酮酸氧化抑制剂Pdk4、β氧化激活剂Cpt1a、Acot3、Ehhadh基因和脂质存储基因Gos2的转录显著增加有关。总之，这些数据表明，SIRT6激活广泛的PPARα信号通路，调节代谢，最终增加β氧化。

为了证明SIRT6对PPARα信号的影响存在PPARα依赖性，使用两种不同的 siRNAs敲除PPARα (KD)，与对照组相比，PPARα KD Hepa1-6细胞中PPRE的SIRT6激活、β氧化基因丙酮酸信号均被显著抑制。表明PPARα介导SIRT6对多个PPARα信号通路的影响。

既往研究表明PPARα的诱导会强烈抑制SREBP1 /2介导的转录。作者使用与前文类似的方法证明了SIRT6调控PPARα抑制的SREBP依赖的胆固醇合成。然后作者研究了SIRT6调节PPARα介导的SREBP抑制的生理效应。NMR分析显示WY处理显著降低肝脏脂肪含量近50%。在SIRT6 TG小鼠中，这种脂肪减少显著增强。而在HZ小鼠中则被抑制，且β氧化减少。这些发现表明，在需要激活PPARα的更广泛条件下，SIRT6将能源利用导向脂肪。

SIRT6是组蛋白去乙酰化酶，通常会导致转录水平降低。作者于是研究了SIRT6激活PPARα的潜在机制是否通过其辅激活物或辅抑制物的去乙酰化。利用SILAC质谱分析发现只有一种蛋白，即已知的PPARα共激活因子NCOA2，在TG小鼠中显示出显著降低的乙酰化水平。且SIRT6可以与NCOA2相互作用。将NCOA2 K780突变为精氨酸(K780R)或谷氨酰胺(K780Q)（二者皆为去乙酰化NCOA2），PPRE的激活显著增强，表明SIRT6通过NCOA2去乙酰化激活PPARα依赖的信号通路。

总结这篇文章，促长寿酶SIRT6可结合PPARα及其在启动子区域的反应元件（PPRE）激活基因转录。SIRT6缺乏会显著降低PPARα诱导的β氧化及其代谢物，降低丙氨酸和乳酸水平，同时诱导丙酮酸氧化。此外，SIRT6介导PPARα抑制的SREBP依赖的胆固醇和甘油三酯的合成。SIRT6与PPARα辅激活因子NCOA2结合，减少后者的乙酰化，从而激活PPARα。本文揭示了SIRT6与各种代谢途径的相互作用，并提示了SIRT6维持肝脏健康的新机制。下图的漫画可形象地总结全文。本文通讯作者科恩教授说：“通过与PPARα协同工作，SIRT6可以向身体发送信号，以燃烧更多的脂肪（特别是在肝脏中）。”

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